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2024-03-08 00:04:09
甘露聚糖酶_百度百科
酶_百度百科 网页新闻贴吧知道网盘图片视频地图文库资讯采购百科百度首页登录注册进入词条全站搜索帮助首页秒懂百科特色百科知识专题加入百科百科团队权威合作下载百科APP个人中心收藏查看我的收藏0有用+10甘露聚糖酶播报讨论上传视频药品本词条缺少概述图，补充相关内容使词条更完整，还能快速升级，赶紧来编辑吧！甘露聚糖酶，即β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长。中文名甘露聚糖酶 [1]外文名endo-β-1外文名Mannanase [1]别 名β-甘露聚糖酶CASNO.37288-54-3 [1]目录1聚糖酶介绍2物理化学性质3产品用途4储运特性聚糖酶介绍播报编辑中文名称：甘露聚糖酶CASNO.：37288-54-3中文别名：β-甘露聚糖酶，D-甘露聚糖酶，甘露聚糖酶，内-1,4-Β-甘露聚糖酶英文名称:endo-β-1英文别名:Mannanase,endo-1,4-beta-;endo-1,4-.beta.-mannanas;endo-1,4-.beta.-Mannanase;endo-B-1,4-Mannanase;beta-MannanaseEINECS:37288-54-3物理化学性质播报编辑β-甘露聚糖酶（endo-1,4-β-mannanase）≥180000U/g，同时含有淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶等生产菌种为缓慢芽孢杆菌；固态型产品外观为米白至淡黄色颗粒或粉状，酶活含量为500000U/g；液态型产品外观为淡黄至黄色液体，酶活含量为500000U/mL。产品用途播报编辑β-甘露聚糖酶为一种多功能的促生长剂，可以促进类胰岛素生长因子IGF-I的分泌，促进蛋白质的合成，提高瘦肉率，促进生长1、消除饲料中甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高豆粕的能量消化率，能给玉米豆粕型日粮提高100-150kcal/kg的代谢能。2、甘露聚糖分解产生的甘露寡糖，可被动物肠道中的有益菌吸收，改善菌群组成，减少大肠杆菌、沙门氏菌的感染。减少肉鸡球虫病的危害，提高肉鸡均匀度。3、降低肠道粘度，促进能量、蛋白、纤维素的消化和吸收。储运特性播报编辑固态型：每吨配合饲料添加60g－100g，可以直接添加或通过预混料添加。在阴凉、避光、干燥、通风条件下贮存，保质期12个月。液态型：通过液体后喷涂工艺，每吨全价饲料添加100mL。在阴凉、避光、密闭条件下贮存，保质期6个月。新手上路成长任务编辑入门编辑规则本人编辑我有疑问内容质疑在线客服官方贴吧意见反馈投诉建议举报不良信息未通过词条申诉投诉侵权信息封禁查询与解封©2024 Baidu 使用百度前必读 | 百科协议 | 隐私政策 | 百度百科合作平台 | 京ICP证030173号 京公网安备110000020000β-甘露聚糖酶的研究及应用进展 - 知乎
β-甘露聚糖酶的研究及应用进展 - 知乎切换模式写文章登录/注册β-甘露聚糖酶的研究及应用进展创联食用胶网来源β-甘露聚糖酶属于半纤维素水解酶类，以内切方式降解β-1,4糖苷键，作用底物为甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等，近来很多研究也表明，甘露聚糖酶还是一种多功能的促生长剂。β-甘露聚糖酶来源广泛，包括植物、真菌、放线菌甚至软体动物，其中，微生物是产生β-甘露聚糖酶的主要来源，但哺乳动物体内不含此酶。作用机理1、去掉β-甘露聚糖酶的抗营养作用甘露聚糖是植物性饲料原料中除纤维素、木聚糖之外，分布最广泛、含量最高的一类半纤维素，而且在许多植物中大量积累，如玉米、小麦、菜籽粕及麦麸中含量占非淀粉多糖比例分别达12% 、11%、20%和34%。特别是β-半乳甘露聚糖和β-葡甘露聚糖是所有豆科如豆粕植物细胞壁的组成成分，在豆粕中含量最高15 - 18g/kg。在饲料中添加β-甘露聚糖酶可水解β一甘露聚糖高分子中的β-1 ,4 糖苷键，释放出与之结合的养分、微量元素等，促进营养物质的消化和吸收，降低肠道粘度，预防动物腹泻，同时促进畜禽生长，减少养殖污染。2、提高动物肠道粘膜的完整性β-甘露聚糖酶可以直接作用于肠黏膜，切断肠上皮细胞与病原菌的结合点，即碳水化合物核心基座、蛋白质和蛋白糖;又因-甘露聚糖酶的反应产物甘露寡糖，可以竞争性地与某些病原菌结合，从而减少了这些有害菌与肠粘膜上皮细胞的连接，进而减少了发病的几率，达到防病抗病和治病的目的。3、促进生长激素分泌在肉鸡受到应激时，β一甘露聚糖酶显著提高类胰岛素生长因子IGF- I和IGF- II水平， IGF -I作用于生长组织，刺激细胞对氨基酸的利用从而促进蛋白质的合成，抑制蛋白质的分解，最终导致蛋白质的净增长。4、促进消化酶的分泌研究发现，β-甘露聚糖酶显著提高了肉仔鸡十二指肠内容物消化酶淀粉酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶活性，尤其是胰蛋白酶、糜蛋白酶提高了86%和69%。β-甘露聚糖酶在生产中的应用1、改善畜禽生产性能以玉米/豆粕为主的低能日粮中添加0.5kg/t的β-甘露聚糖酶和美酵素可达到与高能日粮中添加金霉素相当的增重效果和饲料报酬。日粮中添加0.5kg/tβ-甘露聚糖酶可提高肉鸡增重和饲料转化率。2、促进动物健康，提高抗病力β-甘露聚糖酶对肉鸡人工感染球虫和产气荚膜梭菌的影响，结果发现β-甘露聚糖酶改善了感染鸡的生产性能，降低了感染鸡的死亡率，具有抗球虫的作用，β-甘露聚糖酶对肉仔鸡成活率的提高效果比金霉素还好。3、提高饲料能量利用率在含22.8%豆粕日粮中添加β-甘露聚糖酶后，能量消化率提高了3. 13%，粗蛋白消化率提高了2.57%粗纤维消化率提高了6.45%，消化能提高了106kcal/kg以上。4、提高家禽产蛋性能添加β-甘露聚糖酶能显著提高蛋鸡的产蛋率，添加量在0.03 %就可达到显著水平国。在蛋鸡日粮中添加不同水平的β甘露聚糖酶对蛋鸡产蛋后期生产性能的影响，结果发现添加β-甘露聚糖酶，产蛋性能及其抗病力高于添加杆菌肽锌。结论β-甘露聚糖酶得以应用，无论是着眼于提高动物产品的品质，提高现有饲料资源的利用率还是在解决抗生素残留问题，减少饲料相关行业的环境污染问题，都会产生良好的经济效益、社会效益和生态效益。本文源自创联食用胶网http://www.shiyongjiao.cn/注：文章部分源于网络，版权归原作者所有，如有侵权，请联系删除~发布于 2019-11-01 15:56酶生物化学生物学赞同添加评论分享喜欢收藏申请
神奇的甘露聚糖酶作用机理、应用领域和使用条件简介 - 知乎
神奇的甘露聚糖酶作用机理、应用领域和使用条件简介 - 知乎首发于生物酶知识与运用切换模式写文章登录/注册神奇的甘露聚糖酶作用机理、应用领域和使用条件简介南宁车服β-甘露聚糖酶（β-Mannanase）是由基因工程菌经深层液体发酵培养，喷雾而成的产品。是一类能够水解含有β-1，4-甘露糖苷键的甘露聚糖的内切水解酶，它属于半纤维素酶类。水解产物主要为甘露寡糖。随着近来对自然界半纤维素资源的开发和甘露寡糖药用价值的发现，β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮，它已在食品、医药、造纸、纺织印染、饲料、石油开采及生物研究技术等多方面得到了广泛运用。应用1、在保健食品方面，β-甘露聚糖酶水解含有甘露聚糖的植物胶生成含有不同糖分子（2-10个）组成的分支甘露低聚糖，其有效地降低人体胆固醇水平、减轻便秘、降低血糖、增加肠内有益菌和减少有害菌等的功能。2、 在加工啤酒酵母系列产品（酵母膏、核酸、酵母细胞壁免疫增强剂）中，β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶联合作用，分解酵母细胞壁。3、 在造纸工业方面，用酶法代替传统的碱法处理纸浆，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等间纤维素降解酶类协同使用，能有效地除去纸浆中的半纤维素，明显改善纸质。4、在纺织工业方面，用作天然纤维至少中半纤维素胶质的降解，如β-甘露聚糖酶用于苎麻脱胶工艺中，具松解纤维，降低苎麻纤维的歼胶，提高精干麻品质的作用。并有效的除去纺织印染产品上粘附的多余染料，以取代常规的化学处理工艺，降低了能耗和环境的污染。5、在石油工业方面，β-甘露聚糖酶还是优质的生物破胶剂，具有效率高、成本低、对地层伤害小的优点。使用条件温度适应范围在40-65℃，最适温度在58-62℃；pH值适应范围在4.6-10.6，最适使用PH在6.0-9.4。产品规格酶活力（单位U/g）：2万，3万，5万执行标准产品符合Q/FSBSA002-2006标准酶活定义在60℃、PH6.0，保温10min条件下，1min催化5mg/ml LBG（Gum，Locus Bean洋槐豆粉）底物溶液生成1μg还原糖（以甘露糖表示）所需的酶量定义为一个酶活力单位（U），以U/g表示。储存：酶制剂在不同贮存温度下，其活力会随时间不同程度地逐渐失去，建议贮存在阴凉干燥的环境下，应在低温条件下避光保存。贮藏过久或贮藏条件不利，如温度湿度过高，则需要在使用时适量的增大添加量。安全： β-甘露聚糖酶属于纯天然的酶制剂，是蛋白质。食用使用酶制剂的食品如同食用含有蛋白质类食物一般，对人体有益无害；对于部分敏感人群，如直接摄入高浓缩的酶粉或雾滴，有可能引起过敏，过长时间接触有可能刺激皮肤、眼睛和粘膜组织。 在操作过程中建议配戴口罩、眼罩等防护用具，剩余或洒出的酶粉需及时处理，对于大量洒出的酶粉应轻轻扫回容器，少量则用真空吸走或用水浸湿清理。β-甘露聚糖酶是一种生物活性物质，易受重金属离子（Fe3+、Cu2+、Hg+、Pb+等）和氧化剂的抑制及破坏作用，在贮存或使用过程中应避免与之接触。包装：铝塑袋包装，1kg×10包/箱；1kg×20包/箱编辑于 2022-03-23 16:12酿酒酶与酶制剂（书籍）造纸工业纺织行业赞同添加评论分享喜欢收藏申请转载文章被以下专栏收录生物酶知识与运用一个专业介绍生物酶制剂的知识以及应用
新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究
新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究
微生物学报 2020, Vol. 60 Issue (12): 2690-2704
DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20200291.
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20200291
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
0
文章信息
刘亮, 刘佳文, 王若楠, 张瑜, 李宝珍, 袁红莉. 2020
Liang Liu, Jiawen Liu, Ruonan Wang, Yu Zhang, Baozhen Li, Hongli Yuan. 2020
新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究
Functional characterization of a novel bifunctional mannanase-acetyl esterase focusing on the synergistic mechanism between different domain
微生物学报, 60(12): 2690-2704
Acta Microbiologica Sinica, 60(12): 2690-2704
文章历史
收稿日期：2020-05-07
修回日期：2020-08-17
网络出版日期：2020-10-21
Abstract
Figures
Tables
引用本文
刘亮, 刘佳文, 王若楠, 张瑜, 李宝珍, 袁红莉. 新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究[J]. 微生物学报, 2020, 60(12): 2690-2704.
Liang Liu, Jiawen Liu, Ruonan Wang, Yu Zhang, Baozhen Li, Hongli Yuan. Functional characterization of a novel bifunctional mannanase-acetyl esterase focusing on the synergistic mechanism between different domain[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2020, 60(12): 2690-2704.
新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶的功能和结构域协同研究
刘亮
,
刘佳文
,
王若楠
,
张瑜
,
李宝珍
,
袁红莉
中国农业大学生物学院, 农业生物技术国家重点实验室, 农业部土壤微生物学重点实验室, 北京 100193
收稿日期：2020-05-07；修回日期：2020-08-17；网络出版日期：2020-10-21
基金项目：农业生物技术国家重点实验室开放研究重点课题（2018SKLAB6-28）
作者简介：袁红莉, 博士, 教授, 博士生导师, 农业生物技术国家重点实验室固定研究人员。主要致力于纤维素、木质素和褐煤等生物质的微生物降解、转化、利用以及微生物肥料等应用基础研究。通过对典型系统中关键蛋白的水解模式和和蛋白间水解协作机制进行研究, 解析了多个包括细菌和真菌在内的生物转化系统; 在此基础上开发了具有商业化潜力的辅助酶系, 用于提高商业纤维素酶的转化效率; 从底物利用、营养互馈和空间占位等多个层面揭示天然菌群中不同物种在转化木质纤维素过程中的新型种间协作机制, 为木质纤维素的高效转化奠定了一定的理论和应用基础。获得农业部中华农业科技奖3项, 教育部科学技术奖1项, 国土资源部科学技术奖1项。主持或参加完成10多项国家及省部级科研项目, 发表文章70多篇, 其中在Biotechnol Biofuels, Bioresour Technol, Appl Environ Microbiol, Microb Cell Fact等杂志上发表SCI收录文章60多篇, 获得授权发明专利二十余项.
*通信作者：袁红莉, Tel/Fax:+86-10-82733349;E-mail:hlyuan@cau.edu.cn.
摘要：[目的] 分析鉴定高效木质纤维素降解菌群EMSD5来源的新型甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884，解析催化域间的协同关系，以及碳水化合物结合模块（CBM）对催化域特性的影响，拓展对该类双功能酶的认识，为甘露聚糖酶的升级改造和应用提供依据。[方法] 通过大肠杆菌异源表达甘露聚糖酶-乙酰酯酶双功能酶44884，并构建截短和定点突变的突变体，利用TLC和DNS法比较野生型和突变体的酶学性质。[结果] 成功对44884全长和突变蛋白进行克隆表达，并发现44884中2个催化域能够彼此促进各自产物的释放，而且以双功能酶形式存在时，这种促进效果更为明显。44884中的2个CBM65均有甘露聚糖和结晶纤维素结合活性，且CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶和乙酰酯酶的最适反应条件和水解模式。虽然CBM65显著降低了2个催化域的热稳定性，但水解天然底物时，2个CBM65对各自临近催化域的水解具有明显的促进效果。[结论] 本研究首次发现并探究了新型甘露聚糖酶和乙酰酯酶形成的双功能酶44884的功能，解析了催化域之间高效的协同效应，以及新型甘露聚糖结合模块CBM65对双功能酶水解的促进作用。
关键词：双功能酶 甘露聚糖酶 乙酰酯酶 结构域协同 碳水化合物结合模块
Functional characterization of a novel bifunctional mannanase-acetyl esterase focusing on the synergistic mechanism between different domain
Liang Liu
,
Jiawen Liu
,
Ruonan Wang
,
Yu Zhang
,
Baozhen Li
,
Hongli Yuan
State Key Laboratory of Agrobiotechnology, Key Laboratory of Soil Microbiology, Ministry of Agriculture, College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, China
Received: 7 May 2020; Revised: 17 August 2020; Published online: 21 October 2020
*Corresponding author:
Hongli Yuan, Tel/Fax: +86-10-82733349; E-mail: hlyuan@cau.edu.cn.
Foundation item: Supported by the Project for Extramural Scientists of State Key Laboratory of Agrobiotechnology (2018SKLAB6-28)
Abstract: [Objective] A novel bifunctional mannanase-acetyl esterase 44884 from lignocellulose-degraded consortium EMSD5 was investigated, including its interdomain synergism. The effect of carbohydrate-binding module (CBM) on the properties of catalytic domain was also studied, to provide references for improving and applying bifunctional enzymes. [Methods] Mannanase-acetyl esterase 44884 and its truncated mutants, as well as site-directed mutant were expressed in E. coli. The differences in the enzymatic properties of the wild type strain and mutants were evaluated by thin-layer chromatography (TLC) and dinitrosalicylic acid (DNS) assay. [Results] Mannanase-acetyl esterase 44884 and its mutants were successfully overexpressed in E. coli. The mannanase domain and acetyl esterase domain showed synergistic effect, and mannanase-acetyl esterase 44884 showed higher production of reducing sugars and acetic acid than the combination of mannanase domain and acetyl esterase domain. Two CBM65 from mannanase-acetyl esterase 44884 could bind mannan and Avicel, and not change the optimal conditions of catalytic domains. Although two CBM65 significantly decreased the thermostability of catalytic domain, they specifically improved the natural substrate hydrolysis of their adjacent catalytic domains. [Conclusion] The synergistic action between different domain of mannanase-acetyl esterase 44884 was illustrated, in which two CBM65 could improve the mannan hydrolysis of mannanase-acetyl esterase 44884 by binding to substrate.
Keywords:
bifunctional enzymes mannanase acetyl esterase interdomain synergism carbohydrate binding module
木质纤维素储量丰富且廉价的特性使其成为生产生物质能源和其他生物基产品的重要原料，但木质纤维素复杂的组分和特殊的抗降解结构仍然是目前酶解转化面临的巨大挑战[1]。其中半纤维素通过结合纤维素和木质素而对水解造成的阻碍是目前行业中面临的重大难题，因此，越来越多的研究通过挖掘高效的半纤维素酶制剂来促进商业纤维素酶的水解效率[2-4]。甘露聚糖是半纤维素的重要组分之一，其在木质纤维素中的占比能够达到15%–25%[5]。甘露糖通过β-1, 4-糖苷键连接形成主链结构，部分甘露糖可被葡萄糖单元取代或者发生半乳糖和高达20%–30%的乙酰化修饰[6-7]，这种侧链修饰极易对水解酶形成空间位阻，影响酶与底物的结合，水解效率下降和甘露糖的可发酵性[8]。利用预处理技术去除甘露聚糖及其侧链结构，提高木质纤维素的酶解效率是目前研究的普遍方法，但考虑到甘露聚糖较高的含量，以及对木质纤维素全组分高效转化的需求，最大化包括甘露聚糖在内的半纤维素的利用是目前生物质转化产业的重要目标。酶法转化甘露聚糖组分不仅可以提高木质纤维素的降解性，而且甘露寡糖等水解产物作为益生元可以进一步提高木质纤维素的商业价值[9]，是半纤维素资源高值、绿色转化的有效手段。 内切甘露聚糖酶是一类能够水解不同甘露聚糖主链的酶类，根据蛋白序列的相似性和结构特征，甘露聚糖酶主要分布在4个糖苷水解酶(glycosyl hydrolase，GH)家族，分别为GH5、26、113和134[10]，大部分集中于GH5和26家族。目前甘露聚糖水解转化的研究更多聚焦于主链的降解以及半乳糖侧链形成的位阻效应[11]，但乙酰基团在甘露聚糖水解过程中造成的阻碍作用却未获得足够的关注。在木聚糖的降解中，乙酰基团的去除能够同时促进木聚糖主链的水解[12]，而且该水解过程可以由木聚糖酶和酯酶形成的双功能酶一步完成[13-14]，然而同时包含甘露聚糖酶和乙酰酯酶催化域的双功能酶仍未见报道，其结构域间的协同模式仍有待进一步揭示。此外，基于对Cellvibrio属来源的甘露聚糖酶的分析，发现GH26家族甘露聚糖酶可能偏向于水解可溶性甘露聚糖，而GH5家族的甘露聚糖酶则更偏向于水解不溶性甘露聚糖[15-16]，这也暗示细菌来源的GH5家族甘露聚糖酶在木质纤维素水解转化中可能具有更高的实际应用价值。但是目前甘露聚糖酶促酶解研究几乎都集中于Trichoderma reesei[17]和其他真菌[18]来源的酶，而针对细菌来源的GH5家族的甘露聚糖酶的研究依然很少。 除了包含多个催化域，大量细菌来源的多功能酶同时含有多个碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding module，CBM)[19-20]，并承担重要功能。高效双功能酶CelA中包含3个CBM (GH9-CBM3-CBM3-CBM3-GH48)，并发挥不同功能，其中2个CBM表现出极强纤维素结合能力，而另一个主要发挥辅助功能。当3个CBM同时存在时，该酶能够从主要水解底物表层转变为向深层降解，在底物中形成大量空腔结构[21]。Gavrilov等[22]将来源于Thermococcus sp.的多催化域酶MDG中的2个CBM3截掉后，发现该酶对葡聚糖、微晶纤维素、甘露聚糖和木聚糖的催化能力均显著下降。由此可见，多CBM在促进多催化域酶与底物的结合、改变酶的作用方式、提高酶的活性层面都发挥了重要作用，在木质纤维素的转化中具有巨大的应用潜力。细菌来源的甘露聚糖酶大部分携带一个或多个CBM，但是多CBM在甘露聚糖酶及其构成的双功能酶中所发挥的功能仍然不明确，这也限制了高效甘露聚糖酶制剂的开发与应用。 本实验室前期从自然环境中富集得到了一个高效且稳定的木质纤维素降解菌群EMSD5[23]。宏基因组和蛋白组分析结果表明该菌群中含有大量多催化域酶和多CBM酶，以秸秆为唯一碳源诱导菌群时，发现一个包含甘露聚糖酶催化域、酯酶催化域和2个CBM65结构的多功能酶44884始终处于高表达的状态，暗示其在天然甘露聚糖转化过程中的重要作用。本文对该双功能酶进行异源表达，并通过构建截短和突变蛋白研究两个催化域间的协同关系，以及2个CBM65对2个催化域的影响。这也是首次报道包含甘露聚糖酶催化域的双功能酶，并揭示了不同催化域间的协同作用和多CBM在该双功能酶中的功能，为高效多功能酶的构建及酶制剂的人工复配提供了实验和理论基础。 1 材料和方法
1.1 主要实验材料
棕榈粕由中国科学院过程工程研究所韩业君研究员惠赠，并进行汽爆处理[24]；油松采集自中国农业大学校园，粉碎后过50目筛，于60 ℃烘干备用。槐豆胶(locust bean gum，LBG)、瓜尔胶(guar gum，GG)、乙酸对硝基苯酯(4-nitrophenyl acetate，pNPAc)购自Sigma公司。魔芋葡甘聚糖(konjac glucomannan，KGM)购自合肥博美生物科技有限责任公司。乙酰化魔芋葡甘聚糖A-KGM的制备如文献[7]所述。TLC Silica gel 60 F254购自Merck KGaA公司。Escherichia coli DH5α和Escherichia coli BL21(DE3)感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。原核表达质粒pET-30a(+)由本实验室保存。细菌菌群EMSD5由本实验室保存。 1.2 重组蛋白的表达及纯化
以EMSD5基因组DNA为模板，利用特异性引物(表 1)，扩增目的片段，连接至pET-30a(+)，构建重组质粒。将含有正确目的片段的重组质粒转化至表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)进行诱导表达后收集菌体，采用超声破碎法获取胞内目的蛋白，进一步采用Ni柱亲和层析法对胞内上清液进行纯化，得到重组蛋白。蛋白浓度按照5×Bradford Protein Assay Reagent说明书进行测定。
表 1. 引物名称和序列
Table 1. Primers used in this study
Names
Sequences (5′→3′)
44884-F1
CGCGGATCCGCAACAGGTACAGCCGCTGGTTTCC
44884-F2
CGCGGATCCACTTTTATGCCTTCTTCC
44884-F3
CGCGGATCCCAAGAGTCAAAGGTACC
44884-F4
CGCGGATCCGGAACATTAAAAGCGCAGAC
44884W362A-F
TGCATCTGCAGCGACAGATGTATTATCTTTCACAACTGTA
44884-R1
CCGCTCGAGCCAGCCCATAACATCTTTGATATAT
44884-R2
CCGCTCGAGATAGTCTGCTGACTCTAAT
44884-R3
CCGCTCGAGATAATCAAATGATTTTAA
44884-R4
CCGCTCGAGAAAAACAGAACAGATATTAG
44884W362A-R
GATTTATTACCACTGA
表选项
1.3 酶学特性的测定
甘露聚糖酶活性测定：用0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)配制0.4% (W/V) KGM底物，按以下体系进行反应：底物(90 μL)，适当稀释的酶液(10 μL)；涡旋混匀后于50 ℃准确反应5 min，加入300 μL DNS试剂终止反应，混匀后短暂离心。沸水浴5 min显色，用冰水混合物终止反应。加入800 μL水稀释，混匀，13523×g离心1 min，测量上清液的OD540。根据标曲计算还原糖释放量和酶活。 酯酶活性测定：称取0.0181 g pNPAc，用1 mL乙醇溶解后取100 μL加入到7.9 mL 0.2 mol/L的磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中作为底物工作液。按照以下体系进行反应：950 μL底物，适当稀释的酶液(50 μL)，涡旋混匀后于50 ℃准确反应15 min，测量溶液的OD405。根据标曲计算pNP释放量和酶活。 最适温度的测定：用最适pH缓冲液配制底物溶液和酶溶液，在梯度温度条件下测量酶活性，确定最适温度。 最适pH的测定：配制梯度pH值的底物溶液和酶溶液。在酶最适反应温度条件下测量酶活性，确定最适pH。 温度稳定性的测定：将酶溶液置于50 ℃条件下酶孵育不同的时间后，在最适条件下测量酶活性。 1.4 酶动力学参数的测定
用最适pH值的缓冲液配制0.1%–1.0% (W/V)的底物溶液，在最适温度条件下测量酶活。利用双倒数作图法计算Km和kcat。 1.5 水解产物的TLC分析
用去离子水配制0.5% (W/V)的底物溶液和400 nmol/L的酶溶液。底物和酶溶液各5 μL，充分混匀后反应0.5 h。反应结束后取6 μL点样至硅胶板上，按文献所述方法进行显色[25]。 1.6 CBM65的底物结合实验
利用亲和电泳的方法检测CBM65对可溶性底物的结合能力。蛋白总上样量5 μg，以等量BSA作为对照样品。冰浴电泳后染色并脱色，观察蛋白条带在无底物和含底物胶上的迁移。计算各蛋白相对于BSA的迁移率Rf (Rf =目的蛋白条带与分离胶上沿距离/BSA条带与分离胶上沿距离)；计算蛋白在含底物胶上的Rf与无底物分离胶上Rf的比值Rs (Rs =目的蛋白在含底物分离胶中的Rf/无底物对照分离胶中的Rf)，Rs > 0.95时认为该蛋白与相应底物无结合能力，标记为“–”；0.95≥Rs＞0.8时认为该蛋白与相应底物具有弱结合能力，标记为“+”；0.8≥Rs＞0.2时认为该蛋白与相应底物具有中等结合能力，标记为“++”；Rs≤0.2时认为该蛋白与相应底物具有强结合能力，标记为“+++”。 1.7 天然底物及乙酰魔芋葡甘聚糖水解实验
天然底物水解反应的总体系为1 mL，底物为20 mg，酶量为4000 nmol/L (终浓度)，于37 ℃、200 r/min孵育24 h。乙酰魔芋葡甘聚糖(A-KGM)水解反应的总体系为1 mL，底物为4 mg，酶量为100 nmol/L (终浓度)，于50 ℃孵育5min。15871×g离心5 min，利用DNS法测量上清液的还原糖浓度。 乙酸产量测定：取样于18407×g离心5 min，取100 μL上清液用2 mol/L的HCl (记下体积)调节pH至2后用0.22 μm滤器过滤。取20 μL滤液上样，利用HPLC测定样液中乙酸根浓度，条件如下：色谱柱(MARS MOA保护柱，MARS MOA 10 U，50 mm×7.8 mm)，流动相(2.5 mmol/L H2SO4)，流速(0.6 mL/min)，柱温60 ℃，数据采集时间(20 min)。根据乙酸标准曲线计算样品中乙酸根浓度，再根据所加HCl体积折算反应体系中的乙酸产量。 2 结果和分析
2.1 重组蛋白r44884及其截短蛋白的异源表达
利用dbCAN数据库对44884蛋白各结构域进行注释，结果表明该蛋白从N端到C端依次是GH5甘露聚糖酶催化域、2个CBM65结构域(CBM65-1/2)和CE2乙酰酯酶催化域(图 1)。为了深入研究该蛋白的功能以及各模块间的协同关系，对不包含信号肽的基因片段进行扩增，在C端融合组氨酸标签后在大肠杆菌表达系统中对全长和突变蛋白进行异源表达。
图 1 44884全长及截短蛋白模块结构展示 Figure 1 Domain organization of 44884 and its truncated mutants. M: the catalytic domain of mannanase; C: the domain of carbohydrate-binding module; E: the catalytic domain of esterase.
图选项
2.2 44884中甘露聚糖酶结构域和乙酰木聚糖酯酶结构域的协同作用
双功能酶在共同进化的过程中，往往能够在不同催化域间形成高效的协同效应，相较于单功能酶，能够表现出更高的酶解效率。本研究通过制备乙酰化的甘露聚糖底物(acetylated konjac glucomannan，A-KGM)分析了44884内部2个催化域间的协作关系。如图 2-A所示，r44884-WT作用于A-KGM后，还原糖含量达到376 μg/mL，而当r44884-MC水解底物时，还原糖的产量仅能达到170 μg/mL，表明乙酰酯酶催化域的存在对于还原糖的释放至关重要，并推测其能够水解底物上的乙酰基团，促进甘露聚糖酶结构域与底物的结合，从而提高酶解效率。将酯酶催化域r44884-CE补充到r44884-MC水解体系中时，还原糖的释放显著提高，但仍然难以达到r44884-WT的水平，说明甘露聚糖酶和乙酰酯酶同时游离存在时仍不足以应对复杂的底物结构，只有形成双功能酶才能充分发挥结构域间的协同作用。此外，研究还发现这种促酶解效果是双向的，甘露聚糖酶催化域的存在同样能够促进乙酰酯酶的酶解，而这两种结构域相互游离存在时所释放的乙酸量同样无法达到r44884-WT的水平(图 2-B)。
图 2 r44884-WT及其截短蛋白水解A-KGM的还原糖 Figure 2 The release of reducing sugar (A) and acetic acid (B) from A-KGM hydrolyzed by r44884-WT and its mutants.
图选项
2.3 CBM65底物结合能力分析
在木质纤维素降解酶中，CBM的主要作用是通过与底物的特异性结合将酶富集在底物表面，增加局部酶浓度，从而提高催化域的降解效率[26]。本研究利用亲和电泳分析了44884中2个CBM65与不同底物的结合能力。结果如表 2所示，2个CBM65无法与榉木木聚糖(beechwood xylan)和无定形纤维素类底物(CMC和β-glucan)结合。但均对甘露聚糖底物LBG表现出一定的结合能力，这与44884中甘露聚糖酶催化域GH5的功能相一致。GG和LBG的主要成分同为半乳甘露聚糖，但GG中半乳糖侧链含量更高[27]，在本研究中的2个CBM都无法与GG相结合。进一步研究发现，2个CBM65对于KGM的结合能力存在差异，其中CBM65-1无法与KGM结合，而CBM65-2与KGM具有一定的结合能力。KGM主链同样由甘露聚糖组成，并含有少量葡萄糖单元，而且几乎没有侧链。考虑到2个CBM65均无法与β-glucan结合，这表明CBM-1与甘露聚糖的结合可能需要识别少量乙酰基团，而CBM65-2与KGM的结合是通过其与甘露糖单元相结合而实现的。综上，2个CBM65的结合特性高度相似，都是具有甘露聚糖和结晶纤维素结合活性的CBM，能够将甘露聚糖酶催化域带到底物附近，促进其水解。
表 2. CBM65与不同底物的结合能力
Table 2. Binding assay of CBM65 to different substrates
CBM65
CMC-Na
Beechwood xylan
β-glucan
GG
LBG
KGM
Avicel
CBM65-1
–
–
–
–
+
–
+
CBM65-2
–
–
–
–
+
+
+
表选项
通过蛋白序列比对分析44884的2个CBM65中参与底物结合的氨基酸残基，进一步解释其与不同底物结合的原因。Luis等[28]结合点突变和结构解析确定了来源于Eubacterium cellulosolvens的EcCBM65-1和EcCBM65-2参与β-glucan结合的关键残基分别为第21位和22位的色氨酸，但是在44884的2个CBM65中，对应位置的残基分别是丝氨酸和谷氨酸，这可能也是这2个CBM65无法结合无定形纤维素的关键。此外，EcCBM65-1第68位和EcCBM65-2第72位谷氨酸分别为参与纤维寡糖结合的关键残基，上述残基在44884的2个CBM65中也未能找到，表明这2个CBM65可能也无法结合纤维寡糖(图 3)。由于目前CBM65家族中参与甘露聚糖结合的残基尚未见报道，44884中CBM65-1和CBM65-2与甘露聚糖结合的具体机制仍有待进一步研究。
图 3 CBM65家族蛋白序列比对 Figure 3 Sequence alignment of CBM65. The conserved tryptophan residues were marked under the sequence; the residues highlighted by dark blue and red were conserved amino acids; the residues marked by light blue were amino acids played a key role in binding substrate.
图选项
2.4 44884中CBM对催化域酶学特性的影响
除了影响催化域与底物的结合，CBM还可能影响酶学特性[29-30]。通过对44884全长及其截短蛋白最适反应条件的分析，探究了CBM65对2个催化域反应温度和pH的影响，结果显示r44884-WT中甘露糖酶的最适反应温度为50 ℃，属于中温酶，最适pH为6.5，在pH 5.0–7.0能够保持70%以上的酶活力(图 4-A、B)。与全长蛋白一致，3个截短蛋白r44884-MCC、r44884-MC、r44884-M的最适反应温度和pH均为50 ℃和6.5，且酶活变化曲线也与全长蛋白相似(图 4-C、D)。上述结果表明，44884中2个CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶催化域的最适反应温度和pH。酯酶的最适反应条件则为40 ℃和pH 7.5，且最适反应条件同样不受CBM65的影响(数据未展示)。
图 4 CBM65结构域对甘露聚糖酶催化域最适反应温度和pH的影响 Figure 4 Optimal temperature and pH for mannanase activity of r44884-WT and its truncated mutants. A: The optimum temperature of r44884-WT; B: The optimum pH of r44884-WT; C: The optimum temperature of the mutants of r44884-WT; D: The optimum pH of the mutants of r44884-WT.
图选项
为了进一步研究44884中CBM65对2个催化域热稳定性的影响，将截短蛋白r44884-MCC、r44884-MC、r44884-M、r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E分别于50 ℃孵育一段时间，并测定其活性变化。如图 5-A所示，r44884-M在孵育5 min后，活力下降至初始值的79%，孵育60 min后，该酶活力剩余47%。而r44884-MCC和r44884-MC在孵育5 min后，酶活力显著下降，分别剩余初始活力的15%和9%，孵育30 min后，二者完全失活。r44884-MCC和r44884-MC的酶活变化曲线相似，表明临近甘露聚糖酶催化域的CBM65 (CBM65-1)的存在对甘露聚糖酶热稳定性的影响更大，同时也说明甘露聚糖酶催化域与CBM间的互作是CBM65影响酶稳定性的关键。与甘露聚糖酶不同，CBM65的存在并不会大幅影响乙酰酯酶的活性，r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E在分别孵育10 min后，酶活分别降至初始活性的48%、54%和61%，延长孵育时间至60 min，r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E分别保留了初始活力的5%、8%和13% (图 5-B)，即2个CBM65的存在都会降低乙酰酯酶的热稳定性，但影响比较微弱。在同一个蛋白中，CBM65对2个催化域热稳定性的影响具有明显差异，这体现了CBM功能的多样性。
图 5 CBM65对(A)甘露聚糖和(B)酯酶催化域热稳定性的影响 Figure 5 The influences of CBM65 on thermostabilities of mannanase (A) and esterase (B). The statistical significance indicated by different letters of numeric value was determined through one-way analysis of variance (ANOVA) followed by LSD test (P < 0.05). The same below.
图选项
除了探究CBM65对不同催化域最适反应条件及热稳定性的影响，本研究进一步通过在KGM和LBG两种甘露聚糖底物上测定r44884-WT及其截短蛋白的kcat/Km分析CBM65对催化域酶活力的影响。结果如表 3所示，失去GH5远端的CBM65后(CBM65-2)，并不影响甘露聚糖酶在不同底物上的kcat/Km值，说明CBM65-2对甘露聚糖催化域的催化效率无显著影响。但失去靠近GH5的CBM65 (CBM65-1)后，r44884-M在KGM和LBG上的kcat/Km值相较于r44884-MC分别提高了2.24倍和3.15倍，表明CBM65-1的存在会显著抑制甘露聚糖酶在上述两种底物上的催化效率。考虑到r44884-M的热稳定性显著高于r44884-MC (图 5-A)，因此这种活性的提高可能是由于蛋白稳定性提高引起的。为了验证这种推测，我们构建了r44884-MC的突变蛋白r44884-MC (W362A)来排除热稳定性对蛋白催化能力的影响，该突变蛋白虽然保留了CBM65-1结构域，但是CBM65-1丧失了与底物的结合能力。与r44884-MC相比，r44884-MC (W362A)在两种底物上的kcat/Km值均下降了24.4%和17.9%，表明CBM65-1的存在能够显著提高甘露聚糖酶的催化能力。
表 3. CBM65对甘露聚糖酶催化域kcat/Km值的影响
Table 3. The influence of CBM65 on the kcat/Km
[L/(g·s)] of mannanase catalytic domain
Substrates
r44884-WT
r44884-MCC
r44884-MC
r44884-M
r44884-MC (W362A)
KGM
44.88±0.11a
43.26±0.22a
42.49±1.07ab
95.09±3.77d
32.11±0.42c
LBG
41.29±0.73bc
39.57±0.56c
39.62±0.61c
124.7±4.06f
32.51±1.67c
表选项
通过测定r44884-CCE、r44884-CE和r44884-E对于模式底物pNPAc的催化活性进一步分析CBM65对于酯酶活性的影响。结果表明，2个CBM65的存在均不影响乙酰酯酶对pNPAc的催化能力(表 4)，这可能是由于CBM无法与pNPAc结合，因而无法体现CBM65对酯酶催化能力的影响。值得注意的是，44884中乙酰酯酶对于pNPAc的活力处于目前文献报道的最高水平。
表 4. CBM65对乙酰木聚糖酯酶比活力(U/μmol)的影响
Table 4. . The influence of CBM65 on the specific activity (U/μmol) of acetylxylan esterase catalytic domain
Substrate
r44884-CCE
r44884-CE
r44884-E
pNPAc
2782.5±26.8a
2724.7±26.7a
2741.2±15.9a
表选项
研究表明CBM的存在可能会改变催化域的水解模式[31]。为了探究44884中GH5甘露聚糖酶的水解模式和CBM65对甘露聚糖酶水解模式的影响，本文进一步探究了r44884-MCC、r44884-MC和r44884-M对不同甘露寡糖的水解情况。结果如图 6-A、B和C所示，3个蛋白分别与甘露二糖和三糖共孵育后，底物组分并无变化，表明3个蛋白均无法水解二糖和三糖。当底物为甘露四糖时，3个蛋白的产物组成主要以三糖为主，并伴有少量的二糖和单糖，表明甘露聚糖催化域与底物结合至少需要4个糖单元，且水解四糖时水解位点主要位于第3个和第4个糖单元之间，从第2个和第3个糖单元间断裂的概率较低。对于甘露五糖，3个蛋白的水解产物主要以二糖和三糖为主，同时有少量单糖和四糖，综合水解四糖时的产物组成，表明3个蛋白主要从五糖的第3和第4个糖单元间断裂糖苷键，少量蛋白从第4和第5个糖苷键间进行水解(图 6-D)。上述结果说明CBM65的存在并不改变甘露聚糖酶的水解模式，但是从2个蛋白水解甘露五糖的结果来看，r44884-MCC和r44884-MC的产物浓度要高于r44884-M，表明CBM65的存在能够提高甘露聚糖酶的催化效率，尤其是CBM65-1，这也与表 3得出的结论一致。
图 6 r44884-MCC (A)、r44884-MC (B)和r44884-M (C)水解甘露寡糖后产物分析及甘露聚糖水解模式推测(D) Figure 6 TLC analyses of hydrolysis products by r44884-MCC (A), r44884-MC (B) and r44884-M (C), and the hypothetical hydrolytic pattern (D). M1: mannose; M2: mannobiose; M3: mannotriose; M4: mannotetraose; M5: mannopentaose; NRE: non-reducing end of mannan oligosaccharides; RE: reducing end of mannan oligosaccharides.
图选项
由于天然底物的结构和组分的复杂性，基于模式底物的分析并不能准确揭示CBM在水解天然底物时的真实功能。棕榈粕是甘露聚糖含量最高的木质纤维素原料之一，可以代表甘露聚糖在天然底物中的状态。因此本研究以汽爆后的棕榈粕为底物，分析r44884-MCC、r44884-MC和r44884-MC (W362A)对其水解情况，准确探究在天然底物上CBM65对甘露聚糖水解效果的影响。如图 7所示，随着CBM65数量的增加，甘露聚糖酶水解能力逐渐提高，而且随着反应时间的延长，临近甘露聚糖酶催化域的CBM65 (CBM65-1)对于甘露聚糖酶的水解促进作用更加显著，这与上述结论相一致。
图 7 CBM65对甘露聚糖酶水解棕榈粕的影响 Figure 7 The influence of CBM65 on hydrolysis of palm meal by mannanase.
图选项
在天然底物上，CBM65对乙酰木聚糖酯酶的酶解促进效果同甘露聚糖酶。r44884-CCE和r44884-CE对于油松中乙酸的释放速率分别达到6.95 μg/(mL·h)和6.73 μg/(mL·h)，但r44884-E的乙酸释放速率仅有4.58 μg/(mL·h)，显著低于携带CBM65的乙酰木聚糖酯酶(表 5)。与甘露聚糖酶一样，临近乙酰木聚糖酯酶结构域的CBM65 (CBM65-2)对酶解的促进效果更为显著。由于在模式底物pNPAc上未观察到CBM65的促酶解效果，表明CBM65-2是通过与底物结合，增加底物上局部的酶浓度来促进酯酶的水解。
表 5. CBM65对酯酶释放油松中乙酸速率的影响[(μg·h)/mL]
Table 5. . The influence of CBM65 on the release of acetic acid from pine by eaterase [(μg·h)/mL]
r44884-CCE
r44884-CE
r44884-E
6.95±0.13a
6.73±0.17a
4.58±0.03b
表选项
3 讨论
甘露聚糖作为重要的生物质资源，其酶法转化受到越来越多的关注。从菌株筛选、诱变到蛋白表达、纯化，再到基因工程、蛋白质工程改造，研究人员围绕甘露聚糖酶作了大量且深入的研究。但是这些研究大部分集中于对甘露聚糖主链的水解，甘露聚糖中独特的乙酰化结构及其产生的抗酶解屏障却未获得足够的重视。在木聚糖酶研究中，乙酰木聚糖酯酶和木聚糖酶间的协同水解作用已被广泛报道[12-14]。在利用甘露聚糖酶水解魔芋葡甘聚糖时，乙酰酯酶的加入同样能够有效提高体系中还原糖的得率[7]，这表明甘露聚糖酶和乙酰酯酶间同样存在协同作用，但是类似的双功能酶却未见报道。此外，大部分报道的双功能酶都是细菌来源，但目前研究更多集中于真菌来源的甘露聚糖酶，这可能也是该类双功能酶研究滞后的原因之一。除了催化域本身，大部分细菌来源的甘露聚糖酶都携带有CBM，这种非催化域结构对于催化域的水解效率、模式和稳定性都有巨大的影响[26, 30]。截止到目前，数据库中已收录的与甘露聚糖结合相关的CBM分别分布在CBM16、23、27、29、35、59、62、72、76和80家族，有晶体结构解析的仅有CBM16、23、27、29、35、59、62和80家族。相较于纤维素酶和木聚糖酶的CBM，甘露聚糖酶的CBM及其对催化域影响的研究仍然稍显滞后。 本研究从前期富集的高效木质纤维素降解细菌菌群中克隆表达了一个双功能酶44884，注释结果表明该蛋白包含2个分别来源于GH5家族和CE2家族的催化域，以及2个CBM65。通过比较全长蛋白和截短蛋白对于A-KGM的水解效率，发现44884中甘露聚糖催化域和乙酰酯酶催化域具有明显的协同效应，都能促进其各自产物的释放，而且当2个催化域相互连接形成双功能酶后，这种协同效果要显著优于2个催化域同时游离存在的情况。这一结果表明细菌作为潜在的双功能酶资源库，有大量新型酶系资源和水解协同机制值得深入挖掘。甘露聚糖酶和乙酰酯酶间形成双功能酶尚属首次发现，在该双功能酶44884中甘露聚糖酶催化域的活力与目前已经报道的文献相比处于中等水平，而乙酰酯酶的活力则处于最高水平，这一结果说明在甘露聚糖酶法转化过程中，提高侧链水解酶的催化能力可能是提高甘露聚糖转化效率的关键，这也为后续甘露聚糖酶的改造和酶系间的复配提供了依据，助力木质纤维素的充分转化利用。 通过对2个CBM65结合活性的分析，发现其与甘露聚糖底物LBG和结晶纤维素具有结合能力，这也是首次发现该家族的CBM能够与甘露聚糖底物结合，其参与结合的残基仍需进一步分析，这一结果进一步丰富了数据库中与甘露聚糖结合的CBM家族。44884中2个CBM65在不影响催化域最适反应条件的情况下却降低了2个催化域的热稳定性。Meng等[32]同样发现CBM的存在会降低木聚糖酶XynA的热稳定性，但也有研究指出CBM的存在能够提高酶的稳定性，Pham等[29]在来源于Aspergillus aculeatus的甘露聚糖酶C端融合一个CBM1后，该蛋白在65 ℃孵育6 h后仍能保留70%的活力，而野生型蛋白几乎失活。可见CBM对酶学性质的影响没有明显规律可循，需要具体问题具体分析。近年来，一些研究发现CBM的存在可能会延伸催化域与底物的结合范围从而导致酶催化模式的改变。Pan等[31]发现CBM会提高酶反应的持续性，从而使得产物中高聚合度寡糖的含量明显提高。在本研究中，2个CBM65并不改变催化域水解模式，但是均能提高各自临近催化域的水解效率，即CBM65-1能够提高其临近的甘露聚糖酶的催化效率，而CBM65-2可以提高其临近的乙酰酯酶的催化效率，而且这种提升效果在天然底物中更为明显，这有利于该酶在木质纤维素转化中的实际应用。
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DOI:10.1128/AEM.03677-14
微生物β-甘露聚糖酶的研究进展
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微生物β-甘露聚糖酶的研究进展
张建新，宋宜乐，冯军厂，常绪路
中国酿造
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2019, Vol. 38
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Issue (4)
: 5-9.
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Issue (4)
: 5-9.
DOI:
10.11882/j.issn.0254-5071.2019.04.002
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微生物β-甘露聚糖酶的研究进展
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出版日期
2019-04-15
发布日期
2019-05-21
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β-甘露聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达及其高效水解甘露聚糖为甘露寡糖。
Applied Microbiology and Biotechnology
(
IF
5
)
Pub Date : 2018-09-15
, DOI:
10.1007/s00253-018-9355-0
Junquan Liu
1
,
Abdul Basit
1
,
Ting Miao
1
,
Fengzhen Zheng
1
,
Hang Yu
2
,
Yan Wang
2
,
Wei Jiang
1
,
Yunhe Cao
3
Affiliation
Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, State Key Laboratory of Agro-Biotechnology, China Agricultural University, Beijing, China.
Liaoning Union Pharmaceutical Company Limited, Benxi, Liaoning, China.
State Key Laboratory of Animal Nutrition, China Agricultural University, Beijing, China.
甘露聚糖的降解是食品和益生元生产的关键过程。β-甘露聚糖酶是水解甘露聚糖中 1,4-β-D-甘露糖苷键的关键酶。β-甘露聚糖酶在毕赤酵母系统中的异源表达被广泛使用；然而，酿酒酵母表达系统更可靠、更安全。我们优化了来自硫曲霉的 β-甘露聚糖酶基因，并在五个酿酒酵母菌株中表达它。在合成营养缺陷或复杂培养基中测试单倍体和二倍体菌株以及具有组成型启动子 TEF1 或诱导型启动子 GAL1 的菌株的酶表达。在复杂培养基中培养的组成型启动子 TEF1 下与 β-甘露聚糖酶基因整合的单倍体菌株 BY4741 的表达效率最高。在发酵罐中的补料分批培养中，36小时后酶活性达到~24 U/mL，生产效率达到16 U/mL/天。最适酶pH为2.0-7.0，最适温度为60℃。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。生产效率达到16 U/mL/天。最适酶pH为2.0-7.0，最适温度为60℃。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。生产效率达到16 U/mL/天。最适酶pH为2.0-7.0，最适温度为60℃。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。最适酶pH为2.0-7.0，最适温度为60℃。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。最适酶pH为2.0-7.0，最适温度为60℃。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。在两种底物的 β-甘露聚糖酶动力学参数研究中，刺槐豆胶半乳甘露聚糖 (LBG) 的 Km = 24.13 mg/mL 和 Vmax = 715 U/mg，而魔芋葡甘露聚糖 (KGM) 的 Km = 33 mg/mL 和 Vmax = 625U/mg。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。1% LBG 的一小时水解效率值为 57%，1% KGM 为 74%，10% LBG 为 39%，10% KGM 为 53%。HPLC分析表明，主要水解产物为低聚糖甘露糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖和甘露六糖。我们的研究结果表明，这种 β-甘露聚糖酶在将甘露聚糖水解为甘露寡糖（一种益生元）方面具有很高的效率，这表明在食品工业中具有强大的潜在应用。
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Secretory expression of β-mannanase in Saccharomyces cerevisiae and its high efficiency for hydrolysis of mannans to mannooligosaccharides.
Degradation of mannans is a key process in the production of foods and prebiotics. β-Mannanase is the key enzyme that hydrolyzes 1,4-β-D-mannosidic linkages in mannans. Heterogeneous expression of β-mannanase in Pichia pastoris systems is widely used; however, Saccharomyces cerevisiae expression systems are more reliable and safer. We optimized β-mannanase gene from Aspergillus sulphureus and expressed it in five S. cerevisiae strains. Haploid and diploid strains, and strains with constitutive promoter TEF1 or inducible promoter GAL1, were tested for enzyme expression in synthetic auxotrophic or complex medium. Highest efficiency expression was observed for haploid strain BY4741 integrated with β-mannanase gene under constitutive promoter TEF1, cultured in complex medium. In fed-batch culture in a fermentor, enzyme activity reached ~ 24 U/mL after 36 h, and production efficiency reached 16 U/mL/day. Optimal enzyme pH was 2.0-7.0, and optimal temperature was 60 °C. In studies of β-mannanase kinetic parameters for two substrates, locust bean gum galactomannan (LBG) gave Km = 24.13 mg/mL and Vmax = 715 U/mg, while konjac glucomannan (KGM) gave Km = 33 mg/mL and Vmax = 625 U/mg. One-hour hydrolysis efficiency values were 57% for 1% LBG, 74% for 1% KGM, 39% for 10% LBG, and 53% for 10% KGM. HPLC analysis revealed that the major hydrolysis products were the oligosaccharides mannose, mannobiose, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, and mannohexaose. Our findings show that this β-mannanase has high efficiency for hydrolysis of mannans to mannooligosaccharides, a type of prebiotic, suggesting strong potential application in food industries.
更新日期：2018-09-13
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季海蕊, 张鑫, 姜静, 赵丹. 乳酸菌β-甘露聚糖酶研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 42(4): 325-329,336. DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2020040294
引用本文:
季海蕊, 张鑫, 姜静, 赵丹. 乳酸菌β-甘露聚糖酶研究进展[J]. 食品工业科技, 2021, 42(4): 325-329,336. DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2020040294
JI Hairui, ZHANG Xin, JIANG Jing, ZHAO Dan. Research Progress of β-Mannanase from Lactic Acid Bacteria[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(4): 325-329,336. DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2020040294
Citation:
JI Hairui, ZHANG Xin, JIANG Jing, ZHAO Dan. Research Progress of β-Mannanase from Lactic Acid Bacteria[J]. Science and Technology of Food Industry, 2021, 42(4): 325-329,336. DOI: 10.13386/j.issn1002-0306.2020040294
乳酸菌β-甘露聚糖酶研究进展
季海蕊,
张鑫,
姜静,
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Research Progress of β-Mannanase from Lactic Acid Bacteria
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β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶（glycoside hydrolases，GH）家族，广泛存在于植物、动物和微生物中，主要水解产物为甘露低聚糖（mannan-oligosaccharides，MOS）。微生物来源的甘露聚糖酶种类多且活性高，但大部分安全性低，其中乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）甘露聚糖酶具有纯化步骤少、易于提取、安全性高等优点，能够满足食品级工业生产的需求，因此在保健品、饲料、饮料生产等工业中有重要应用前景。本文介绍了天然LAB甘露聚糖酶的产酶条件、分离纯化和酶学特性，简述了近年来甘露聚糖酶的LAB重组表达及其在果汁澄清和制备益生元MOS方面的应用，为LAB甘露聚糖酶的基础研究和开发提供参考和依据。
Abstract:
β-mannanase belongs to glycoside hydrolases family and widely exists in plants,animals and microorganisms. Its main hydrolytic product is mannan-oligosaccharides(MOS). There are many kinds of mannanase from microorganisms and their activities are high,but most of them are low in safety. Lactic acid bacteria(LAB)mannanase has the advantages of few purification steps,easier extraction,and higher safety,so it has an important application prospect in food grade fields,including health products,feeds,beverages and other industries. In this paper,the enzyme production conditions,isolation and purification and enzymatic characteristics of natural LAB mannanase were introduced. The LAB recombinant expression of mannanase in recent years and its application in juice clarification and preparation of prebiotics MOS were briefly described,providing reference and basis for the basic research and development of mannanase from LAB.
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β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析
微生物学报 2016, Vol. 56 Issue (2): 301-308
http://dx.doi.org/10.13343/j.cnki.wsxb.20150276
中国科学院微生物研究所，中国微生物学会，中国菌物学会
0
文章信息
李剑芳, 董运海, 胡蝶, 王春娟, 唐诗涵, 邬敏辰
Jianfang Li, Yunhai Dong, Die Hu, Chunjuan Wang, Shihan Tang, Minchen Wu
β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析
Correlation between superior enzymatic properties of β-mannanase AuMan5A/Af and its residue Asp320
微生物学报, 2016, 56(2): 301-308
Acta Microbiologica Sinica, 2016, 56(2): 301-308
文章历史
收稿日期：2015-06-19
修回日期：2015-09-11
网络出版日期：2015-09-15
Abstract
Figures
Tables
引用本文
李剑芳, 董运海, 胡蝶, 王春娟, 唐诗涵, 邬敏辰. β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析[J]. 微生物学报,2016 56(2): 301-308.
Jianfang Li, Yunhai Dong, Die Hu, Chunjuan Wang, Shihan Tang, Minchen Wu. Correlation between superior enzymatic properties of β-mannanase AuMan5A/Af and its residue Asp320[J]. Acta Microbiologica Sinica, 2016 56(2): 301-308.
β-甘露聚糖酶AuMan5A/Af酶学性质的改善与其Asp320的相关性分析
李剑芳1, 董运海1, 胡蝶2, 王春娟1, 唐诗涵1, 邬敏辰3
1. 江南大学, 食品学院, 江苏 无锡 214122;2. 江南大学, 生物工程学院, 江苏 无锡 214122;3. 江南大学, 无锡医学院, 江苏 无锡 214122
收稿日期: 2015-06-19; 修回日期: 2015-09-11; 网络出版日期: 2015-09-15
资助课题: 国家自然科学基金 (31271811)
通讯作者: 邬敏辰, Tel/Fax：+86-510-85329042；E-mail：biowmc@126.com
摘要: [目的] 为改善宇佐美曲霉5家族β-甘露聚糖酶 (AuMan5A) 的酶学性质,本实验室前期将AuMan5A底物结合凹槽内一个7肽 (316KSPDGGN322) 组成的loop替换为烟曲霉5家族β-甘露聚糖酶对应的氨基酸片段 (PSPNDHF),得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。为揭示AuMan5A/Af酶学性质显著改善与其Asp320的相关性,定点突变构建突变体AuMan5A/Af D320G。[方法] 采用大引物PCR技术将AuMan5A/Af 基因 (Auman5A/Af) 中编码Asp320的密码子GAC突变为Gly320的GGT,构建出突变体基因Auman5A/AfD320G,并在毕赤酵母GS115中进行表达,分析表达产物AuMan5A/Af D320G的酶学性质。[结果] AuMan5A/Af D320G的最适温度Topt为70.0 ℃,变性温度Tm为71.5 ℃,介于AuMan5A (Topt=65.0 ℃,Tm=64.5 ℃) 和AuMan5A/Af (Topt=75.0 ℃,Tm= 76.6 ℃) 之间;在70.0 ℃的半衰期为40 min,高于AuMan5A的10 min,但较AuMan5A/Af的480 min显著缩短;比活性分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的2.7和0.3倍;催化效率 (kcat/Km) 分别是AuMan5A和AuMan5A/Af的3.9和0.3倍。[结论] 将Asp320突变为Gly320显著影响了AuMan5A/Af的酶学性质,证明了Asp320对AuMan5A/Af温度特性改善、比活性和催化效率显著提高的重要作用。
关键词:
β-甘露聚糖酶 loop替换 定点突变 酶学性质
Correlation between superior enzymatic properties of β-mannanase AuMan5A/Af and its residue Asp320
Jianfang Li1, Yunhai Dong1, Die Hu2, Chunjuan Wang1, Shihan Tang1, Minchen Wu3
1. School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;2. School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China;3. Wuxi Medical School, Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu Province, China
Supported by the National Natural Science Foundation of China (31271811)
Corresponding author. inchen Wu, Tel/Fax: +86-510-85329042; E-mail: biowmc@126.com
Received: 19 June 2015; Revised: 11 September 2015; Published online: 15 September 2015
Abstract:[Objective] AuMan5A is a glycoside hydrolase (GH) family 5 β-mannanase from Aspergillus usamii. To improve its enzymatic properties, we have previously constructed a mutant with loop substitution, AuMan5A/Af, by substituting a loop of seven residues (316KSPDGGN322) in its substrate binding groove with the corresponding region (PSPNDHF) of A. fumigatus GH family 5 β-mannanase. To reveal the correlation between the superior enzymatic properties of AuMan5A/Af and its residue Asp320, site-directed mutagenesis was used to obtain a new mutant enzyme AuMan5A/Af D320G. [Methods] Using megaprimer PCR method, we constructed a new mutant-encoding gene, Auman5A/Af D320G by mutating an Asp320-encoding codon GAC of Auman5A/Af into a Gly320-encoding GGT. Then, Auman5A/Af D320G was extracellularly expressed in Pichia pastoris GS115, and the enzymatic properties of the expressed product were analyzed. [Results] Analytical results indicated that the optimal and melting temperature of AuMan5A/Af D320G was 70.0 ℃ and 71.5 ℃, repectively, higher than those of AuMan5A (Topt=65.0 ℃, Tm=64.5 ℃) and lower than those of AuMan5A/Af (Topt=75.0 ℃, Tm=76.6 ℃); its half-life at 70.0 ℃ was 40 min, 10 min longer than that of AuMan5A but greatly shorter than 480 min of AuMan5A/Af. Besides, its specific activity was 2.7 fold and 0.3 fold that of AuMan5A and AuMan5A/Af, respectively, and its catalytic efficiency (kcat/Km) was 3.9 fold and 0.3 fold that of AuMan5A and AuMan5A/Af. [Conclusion] The mutation of Asp320 into Gly320 greatly affected the temperature characteristics and catalytic activity of AuMan5A/Af, demonstrating that Asp320 plays an improtant role in temperature characteristics, specific activity and catalytic efficiency improving of AuMan5A after loop substitution.
Key words:
β-mannanase loop substitution site-directed mutagenesis enzymatic properties
β-甘露聚糖酶是内切β-1,4-甘露聚糖甘露糖苷水解酶的简称，能够随机催化甘露聚糖分子主链中β-1,4-D-甘露糖苷键的水解，是甘露聚糖降解酶系中最重要的组分[1]。它广泛存在于多种生物体内，尤其是微生物中，并且在食品、医药、饲料、纺织、纸浆漂白及能源开发等众多领域具有巨大的应用潜力[2, 3]。基于一级结构同源性比对和疏水簇分析，绝大多数β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶 (GH) 第5、26和113家族，具有相似的 (β/α)8-TIM桶状折叠结构，同归于糖苷水解酶A簇 (GH clan-A)[4]。其中，GH 5作为最大的家族包含了细菌和真核来源的β-甘露聚糖酶，而另外两个家族主要以原核来源为主。迄今为止，已有许多丝状真菌的GH 5家族β-甘露聚糖酶编码基因被克隆和表达，并分析了它们的酶学性质[5]，然而关于β-甘露聚糖酶结构与功能的研究却鲜有报道[6]。最近，Huang等[5]基于黑曲霉Aspergillus niger β-甘露聚糖酶的晶体结构分析，对酶蛋白分子进行定点突变，提高了β-甘露聚糖酶的比活性。
近年来，已有研究发现改造位于糖苷水解酶活性中心附近的loop能提高其催化活性和 (或) 热稳定性[7, 8, 9]。本实验室前期克隆了宇佐美曲霉A. usamii GH 5家族β-甘露聚糖酶基因Auman5A，并在毕赤酵母GS115中实现了表达[10]；其后，为改善AuMan5A的酶学性质，我们对GH 5家族β-甘露聚糖酶一级、三维结构的比对和分析，设计将AuMan5A的底物结合凹槽侧壁上一个loop替换为来源于烟曲霉A. fumigatus GH 5家族β-甘露聚糖酶的对应氨基酸片段，通过构建突变基因并在毕赤酵母GS115中表达，得到loop替换突变酶AuMan 5A/Af。酶学性质分析表明，AuMan5A/Af的温度特性和催化活性都有显著改善。为鉴定AuMan5A/ Af替换的loop中Gly320突变为Asp320与其酶学性质改善的相关性，借助定点突变构建突变体基因Auman5A/Af D320G，将该基因在毕赤酵母GS115中表达，分析比较AuMan5A、AuMan5A/Af和AuM an5A/Af D320G的温度特性、比活性和催化效率。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和培养基：大肠杆菌Escherichia coli JM109和DH5α菌株、毕赤酵母Pichia pastoris GS115菌株和表达质粒pPICZαA，重组毕赤酵母GS115-Auman5A、GS115-Auman5A/Af以及GS115-pPICZαA (空白对照) 由作者所在实验室保藏；克隆质粒pUCm-T，购自上海Sangon公司；重组质粒pUCm-T-Auman5A/Af，由本实验室构建和保藏；LB、LLB、YPD、YPDS-Zeocin、BMGY和BMMY培养基的配制，参照EasySelectTM Pichia Expression Kit (Invitrogen) 操作手册。
1.1.2 主要试剂 各种限制性内切酶、rTaq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、250 bp DNA Ladder Mar-ker和低相对分子质量蛋白质Marker，均购自大连TaKaRa公司；Zeocin和EZ-10柱式DNA胶回收试剂盒，购自上海Sangon公司；角豆胶和标准甘露糖为Sigma公司产品；Protein Thermal Shift (PTS) Kit购自美国Applied Biosystems公司；其它试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 β-甘露聚糖酶loop替换突变酶的分析
在PDB数据库 (http://www.rcsb.org/) 寻找与AuMan5A序列 (GenBank: ADZ99027) 同源性高的GH 5家族β-甘露聚糖酶晶体结构，选择A. niger β-甘露聚糖酶晶体结构 (PDB: 3WH9) 和糙刺篮状菌Talaromyces trachyspermus β-甘露聚糖酶 (PDB: 3WFL) 作为AuMan5A和AuMan5A/Af同源建模的模板；运用MODELLER 9.11程序 (http://salilab. org/modeller/) 进行三维结构同源建模。针对酶蛋白分子的三维结构，使用PyMol软件 (http://pymol. org) 分析各位点的空间信息。
1.3 重组表达质粒的构建
基于对AuMan5A/Af一级和三维结构的分析，拟将AuMan5A/Af所替换loop结构中的Asp320 突变为AuMan5A对应的Gly320，即将Auman5A/Af 中编码Asp320的密码子GAC突变为编码Gly320的GGT。根据Auman5A/Af和Auman5A核苷酸序列 (GenBank: HQ839639) 设计PCR引物，由上海Sangon公司合成。
D320G-F：5′-GGCCATCCCCAAAT CAC TTCACTATCTAC-3′(加框部分为突变密码子)；Man5A-F：5′-下划线 GAATTCTCCTTCGCCAGCAC CTC-3′(下划线部分为EcoRⅠ酶切位点)；Man5A-R：5′-GCGGCCGCTTAGGCACTATCAATAGC AG-3′(下划线部分为NotⅠ酶切位点)。
以pUCm-T-Auman5A/Af为模板、D320G-F和Man5A-R为引物，PCR扩增基因片段DM；再利用同一模板、Man5A-F和DM为引物，采用大引物PCR技术[11]扩增突变体基因Auman5A/Af D320G。将目的PCR产物与pUCm-T连接，获重组质粒pUCm-T-Auman5A/Af D320G，转化E. coli JM109，阳性转化子的测序结果与预期一致。将pUCm-T-Auman 5A/Af D320G分别经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切，回收目的条带，与经同样双酶切的pPICZαA连接，获重组表达质粒pPICZαA-Auman5A/Af D320G，转化E. coli DH5α，DNA测序验证。
1.4 β-甘露聚糖酶的表达和纯化
将测序正确的pPICZαA-Auman5A/Af D320G分别用SacⅠ线性化，电转化P. pastoris GS115。重组毕赤酵母的鉴定和多拷贝筛选参照EasySelectTM Pichia Expression Kit操作手册，诱导表达参见文献[12]。β-甘露聚糖酶的纯化参见文献[10]。
1.5 β-甘露聚糖酶活性和蛋白的分析
β-甘露聚糖酶活性测定参见文献[12]，并略作修改。在2.4 mL的5 mg/mL角豆胶溶液 (pH 3.6、50 mmol/L柠檬酸–Na2HPO4缓冲液配制) 中加入0.1 mL适当稀释的酶液，65℃准确反应10 min，加入2.5 mL DNS试剂，在沸水浴中显色7 min，测定OD540值。在上述反应条件下，每分钟产生1 μmol还原糖 (以甘露糖计) 所需的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位 (U)。采用SDS-PAGE分析重组表达产物；Bradford法测定蛋白质含量。
1.6 温度对β-甘露聚糖酶活性及稳定性的影响
在不同温度 (50–75℃) 下，按1.6方法测定酶活性。最适温度Topt定义为最高酶活性 (以相对酶活性100%计) 所对应的温度。将酶液置于70℃下处理不同时间，按1.6方法测定残余酶活性，未经处理酶液的酶活性以100%计。酶的半衰期t1/270定义为经70℃处理残余酶活性为50%时所对应的时间。
采用PTS方法测定AuMan5A、AuMan5A/ Af和AuMan5A/AfD320G的变性温度 (melting tempe-rature,Tm)。具体方法参见文献[13]，并略作修改。按照PTS Kit操作手册将蛋白质样品和荧光染料混合，利用罗氏LightCycler 480 II实时定量PCR系统，在50–95℃温度范围内，以1℃/min的升温速率，在激发和发射波长分别为533 nm和640 nm下检测荧光信号，绘制溶解曲线；利用“Tm calling”分析方法获得衍生熔解曲线，其峰值对应的温度即为Tm值。
1.7 β-甘露聚糖酶动力学常数的测定
以不同浓度 (1.0–10.0 mg/mL) 的角豆胶溶液 (用pH 3.6、50 mmol/L柠檬酸–Na2HPO4缓冲液配制) 为底物，在酶各自的最适温度下按1.6方法测定其活性，采用Origin 8.0软件进行非线性拟合，计算β-甘露聚糖酶的Km和kcat值。
2 结果和分析
2.1 AuMan5A/Af关键位点的确定
将AuMan5A一级结构中位于C末端316至322位氨基酸残基 (KSPDGGN) 组成的loop替换为A. fumigatus GH 5家族β-甘露聚糖酶[14]对应的片段 (PSPNDHF) (图 1，外框显示)，得到loop替换突变酶AuMan5A/Af。经初步分析，该突变酶相对于原酶表现出最适温度、热稳定性、比活性和催化效率都有显著提高，pH特性并未明显改变。该loop接近C末端，连接最后一个α螺旋，由7个残基组成 (图 1)。AuMan5A/Af与原酶的loop共有5个残基不同，考虑到氨基酸的性质差异，G320D和G321H是loop替换中最显著的突变。另外，AuMa n5A/Af的三维结构显示320位残基更可能接近于酶与底物结合时的底物，该点对酶与底物的相互作用的影响可能更大。因此，拟借助定点突变将AuMan5A/Af 320位Asp突变为原酶对应的Gly (图 1，内框显示)，构建突变体AuMan5A/Af D320G。
图 1.
AuMan5A与其突变体C末端的多序列比对及二级结构分析
Figure 1.
Multiple sequence alignment and secondary structure analysis of C-termini among AuMan5A and its two mutants. The legends of secondary structure are as follows: curve-α helix; arrow-β strand; beeline-loop.
图选项
2.2 β-甘露聚糖酶的表达和纯化
将利用大引物PCR方法构建成功的突变基因Auman5A/Af D320G克隆至pPICZαA，获得重组表达质粒pPICZαA-Auman5A/Af D320G。电转化P. pastoris GS115，挑选若干在YPDS-Zeocin (400 mg/mL) 平板上生长良好的单菌落，与GS115/Auman5A、GS115/Auman5A/Af和GS115/pPICZαA菌株一样，经1.0% (V/V) 甲醇诱导96 h，筛选到产AuMan5A/ Af D320G活性最高的转化子，命名为GS115/Auman 5A/Af D320G，酶活性为156.2 U/mL。将表达上清液分别经 (NH4)2SO4盐析、阴离子交换层析和凝胶层析分离纯化。SDS-PAGE分析显示，纯化的AuMan5A/Af D320G与AuMan5A和AuMan5A/Af相似，在约49.5 kDa (表观相对分子质量) 处呈现单一条带 (图 2)。按1.6方法测得纯化酶的比活性为1080.8 U/mg，分别是AuMan5A (405.9 U/mg) 和AuMan5A/Af (3631.1 U/mg) 的2.7和0.3倍。
图 2
诱导表达上清液和纯化酶的SDS-PAGE分析
Figure 2
SDS-PAGE analysis of the expression supernatants and purified enzymes. M, protein marker; 1, The cultured supernatant of GS115/Auman5A/ AfD320G; 2–4, The purified AuMan5A, AuMan5A/Af and AuMan5A/AfD320G.
图选项
2.3 β-甘露聚糖酶温度特性的分析
按1.7方法分析了温度对AuMan5A/Af D320G活性和稳定性的影响，与AuMan5A和AuMan5A/ Af一起，如图 3所示。由图 3-A可见，AuMan5A/ Af D320G的最适温度Topt为70℃，低于AuMan5A/ Af的75℃，高于AuMan5A的65℃。由图 3-B可见，AuMan5A/Af D320G在70℃的半衰期t1/270为40 min，是AuMan5A (t1/270=10 min) 的4倍。而Au Man5A/Af在70℃非常稳定，经测量其t1/270为480 min。AuMan5A/Af D320G的半衰期仅是AuMan 5A/Af的8%。
图 3.
AuMan5A及其突变体温度(A)及稳定性(B)的分析
Figure 3.
Analysis of temperature optima (A) and stabilities (B) of AuMan5A and its mutants at 70 °C.
图选项
变性温度Tm表示在温度上升过程中酶蛋白三维结构发生解折叠到一半时对应的温度，酶蛋白热稳定性越高，Tm值越高[15]。因此Tm值是评价酶热稳定性的重要参数。PTS是一种新兴的基于荧光技术分析蛋白质稳定性的方法，当酶蛋白随着温度升高而解折叠的过程中，其内部的疏水性氨基酸不断暴露出来，与染料结合，产生荧光信号[16]。由图 4衍生熔解曲线上可知，AuMan5A和AuMan 5A/Af的Tm值分别为64.5℃和76.6℃，而AuMan 5A/Af D320G的Tm值为71.5℃，介于两者之间。此研究结果与上述分析结果一致，证明D320G突变明显降低了AuMan5A/Af的热稳定性，将Gly320突变为Asp是AuMan5A的loop替换后热稳定性显著提高的重要原因。
图 4.
AuMan5A及其突变体的衍生熔解曲线
Figure 4.
Derivative melting curves of AuMan5A and its mutants.
图选项
按1.3方法模拟了AuMan5A/Af的三维结构。利用PyMol软件分析表明，Asp320的侧链与Trp306，Gln307以及Phe322形成了3个氢键 (图 5-A)，而AuM an5A中Gly320并无此作用 (图 5-B)。因此，Asp320与周围氨基酸残基的氢键作用使得该点所在的 loop更加稳固，从而提高了酶蛋白分子的刚性[17]。
图 5.
AuMan5A(A)和AnMan5A/Af(B)局部结构的分析
Figure 5.
Analysis of the local structures between AuMan5A (A) and AnMan5A/Af (B).
图选项
2.4 酶动力学常数的测定
在AuMan5A/Af D320G的最适温度下，按1.8方法测定突变体对角豆胶的Km和kcat值，与AuMan 5A和AuMan5A/Af的动力学常数比较如表 1所示。AuMan5A/Af的Km值是原酶的78%，而kcat值是原酶的9.9倍，使得AuMan5A/Af的催化效率 (kcat/Km) 是原酶的12.6倍。AuMan5A/Af D320G的Km值较AuMan5A/Af下降了25%，而kcat值仅为AuMan5A/ Af的23%，使得催化效率大幅降低，是原酶的3.9倍。测定结果显示，D320G突变明显降低了AuMan5A/Af的催化效率，将Gly320突变为Asp是AuMan5A/Af催化效率显著提高的重要原因。
表 1. AuMan5A及其突变体的动力学常数
Table 1. Kinetic parameters of AuMan5A and its mutants
EnzymesKm/(mg/mL)kcat/skcat/Km/[mL/(mg?s)]Fold
AuMan5A1.80±0.07409.0±8.8227.21.0
AuMan5A/Af1.41±0.034051.7±83.32873.512.6
AuMan5A/AfD320G1.06±0.04928.6±24.2876.03.9
表选项
3 讨论
AuMan5A/Af所替换的loop位于β-甘露聚糖酶底物结合凹槽的一端，不直接参与构成凹槽中部的活性中心。AuMan5A/Af酶学特性的改善表明该loop不仅影响了β-甘露聚糖酶的催化特性，而且还与其热稳定性相关。为鉴定Gly320突变为Asp320与AuMan5A/Af酶学性质显著改善的相关性，本研究借助定点突变构建突变体编码基因Auman5A/Af D320G并在毕赤酵母中表达，分析表达产物的酶学性质。结果表明将Asp320突变为Gly320 后，酶的最适温度、热稳定性、比活性和催化效率都出现了明显下降。分析其它GH 5家族β-甘露聚糖酶的loop氨基酸序列发现，对应AuMan 5A 316至322位的氨基酸大都不保守，唯独320位Asp的出现频率非常高，说明该位点的Asp在GH 5家族β-甘露聚糖酶中保守。Dilokpimol等[18]认为对应于AuMan5A 318、319和320位处的氨基酸残基参与了底物结合位点 (subsite) 的形成。其中320位氨基酸残基 (通常为Asp) 能与底物糖环形成氢键，参与形成subsite-2。本研究证明Asp320是AuMan5A/Af催化活性提高的关键因素。另外，Asp320与周围氨基酸残基形成的3个氢键能更好地稳定loop，所以Asp320对AuMan5A/Af的耐热性有重要作用。
β-甘露聚糖酶是水解自然界第二大半纤维素资源的重要组分，然而其结构与功能的研究明显滞后于木聚糖酶。这一方面的原因是其底物的多样性，更主要原因是其均一的桶状结构为开展其研究带来困难。本研究在深入分析GH 5家族β-甘露聚糖酶三维结构信息和氨基酸位点保守性的过程中，发现了影响β-甘露聚糖酶酶学性质的关键loop和其中的关键氨基酸位点，为β-甘露聚糖酶结构与功能的研究开创了新的思路并提供了实验依据。
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